氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统及其制备方法与流程

　　本发明针对传统酶催化体系中酶难以回收、利用率低的问题，提出将漆酶与介体共固定于氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子上。通过磁性分离实现便捷回收，氧化石墨烯增强电子传递效率，明显提升催化性能与重复使用性，降低生产成本。

　　本发明属于制备固定化酶领域，具体涉及一种氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统及其制备方法。

　　随着经济的迅速发展，水环境污染日益严重，有机污染物的日积月累导致的水体污染，严重危害到生态的健康和人类的可持续发展。其中造成水污染的一个原因是染料工业中印染废水排放，已成为危害最大的难以治理的重要污染源。当前应用的染料主要包含有偶氮类、蒽醌类、靛蓝类和三苯甲烷类染料，这些染料生物可降解性低，而且具有致突变和致癌等毒性。跟传统方法相比，生物法降解染料效果稳定，绿色环保，更具发展前途。生物降解是指利用某种微生物或酶作用于染料分子，经过氧化、还原等一系列过程将染料分子降解为简单的无机物或者有机物。研究表明，含蒽醌类物质的废水可以被漆酶催化降解，而其它的不是漆酶的直接底物的染料废水，也能借助某些小分子介体，降解效果可以明显提高，时间也快速缩短，提升了其工业应用的价值。

　　漆酶（EC 1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于植物、昆虫、真菌、细菌中。其氧化反应机理主要体现为底物自由基的生成和漆酶分子中4个铜离子的协同作用。漆酶分子一般含有4个铜离子，在漆酶催化反应的过程中，4个铜离子在酶与底物间进行电子传递，从而氧化底物为自由基，随后自由基通过漆酶进一步催化氧化或非酶催化反应生成各种产物。作为一种特殊的氧化还原酶类，漆酶具有较广泛的底物专一性和较强的稳定性，能利用氧气催化氧化多种酚类和芳香胺类化合物，底物范围相当广阔。因此漆酶在废水净化处理、食品加工、芳香化合物转化、环境监视测定、生物医药以及传感器研制等方面具备极其重大的应用价值。但游离漆酶在使用的过程中易随环境的变化而变性失活，且其不可重复使用性，这在某些特定的程度上限制了漆酶的工业化应用。

　　通过对游离酶进行固定化，一般会情况下可在某些特定的程度上提高酶的耐热性、有机溶剂耐受性和极端环境稳定性，同时还具有可重复使用和易于从反应体系中分离出来的特点。因此，对漆酶进行固定化研究和其应用是实现漆酶工业化应用的有效手段。游离酶的固定化方法大体上分为吸附法、包埋法、交联法和共价法，按酶和载体结合的方式来分，酶的固定化方法大致上可以分为两类：物理方法（物理吸附法和包埋发）和化学方法（离子吸附法、共价结合法和交联法）。不过，虽然已经报道了大量漆酶固定化的研究工作，但任旧存在各种各样的不足，到目前为止，还没有一种固定化漆酶能实际应用于工业生产。另一方面，由于漆酶的氧化还原电位较低，导致其底物范围较窄，为客服这一问题，人们以TEMPO、HBT等小分子物质作为介体开发构建了高效的漆酶-介体系统，主要是通过漆酶先将介体氧化成稳定且活性高的中间态，被氧化的中间态直接从底物中夺取一个电子，再将它传递给氧气分子，使底物分解，反应完成，以拓展漆酶的应用场景范围。但随之而来的问题是小分子介体尽管添加量少，但由于价格普遍比较高、且没办法回收利用，因而也无法推动漆酶的规模化工业应用。

　　将磁性氧化石墨烯纳米材料应用于酶的固定化慢慢的变成了研究的热点。由于磁性氧化石墨烯纳米载体材料本身既具有磁性材料的磁响应和粒子表面积大、粒径小的特点，同时又具有氧化石墨烯的比表面积大、化学性质稳定、可提高物质之间的电子传递效率等，给固定化酶带来了优势，如易分离、不易被反应环境中的酸碱等腐蚀、稳定性强、回收率高、成本低等。目前为止，固定化漆酶和固定化介体均有相关的研究报道，但还未曾发现共价交联共固定化漆酶与介体的报道。因此，本发明拟通过对磁性氧化石墨烯纳米粒子进行氨基化修饰，并共价交联同时固定漆酶和TEMPO介体。

　　本发明的目的是提供一种氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统及其制备方法，由于磁性材料本身表面上不含有羟基，而是要通过四甲基氢氧化铵来使磁性材料羟基化，来使APTES连接到磁性材料上，使磁性材料氨基化，而本发明使用的复合材料，其中一种是氧化石墨烯，其本身表面富有丰富的羟基和羧基，这样经过氨基化修饰后其材料的表面会形成更多的氨基，可拿来固定更多介体和漆酶。用于解决游离漆酶和TEMPO 介体固定化到载体上的含量低，使用效率低，同时，氧化石墨烯能大大的提升物质之间的电子传递效率，这样做才能够提高漆酶与介体之间的作用效率问题，使其降解效率更好，以及不易分离和不能重复利用的问题，。

　　所述氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统的制备方法，包括如下步骤：

　　1）Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子的制备：先将石墨粉、高锰酸钾、浓硫酸、磷酸充分混合，控制其放热过程，使其温度小于35℃，混合完成后，加热至50℃，搅拌10-14 h，反应完成后冷却至室温，加入150 mL冰水（含有10 mL30%H2O2），继续搅拌1-2 h,反应完全后依次使用200 mL去离子水、200 mL30%HCl、200 mL乙醇洗涤，最后溶液离心，真空干燥，即可得到氧化石墨烯；将制备好的氧化石墨烯配置成溶液，再将其与FeCl2、FeCl3充分混合、，在N2保护、搅拌、85°C 水浴的条件下，加入NH3·H2O溶液，并持续搅拌0.5-1 h后，将黑色产物分离出来，去离子水洗至中性，得到Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子，然后将Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子置于7 (wt)% 的四甲基氢氧化铵水溶液中静置2 h，用水洗涤3-5 次备用；

　　2）Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子表面修饰3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）：将步骤1）制备得到的Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子置于乙醇水溶液中，然后加入APTES，50℃，搅拌反应10h，反应产物用去离子水清洗3-5次后，真空干燥，得到表面氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子；

　　3）介体的固定化：取步骤2）得到的氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子置于戊二醛溶液中静置2h，去离子水洗数次以除去多余的戊二醛，加入4-NH2-TEMPO，室温下震荡反应5h，反应结束后，分离出产物，水洗，得到接枝了介体的纳米粒子；

　　4）漆酶的固定：将漆酶加入50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲中，再加入接枝了介体的纳米粒子，35°C震荡反应5h 后，再以50 mM pH 4.5 的乙酸-乙酸钠缓冲清洗数次，以洗去未固定的酶，得到氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统。

　　步骤1）中石墨与高锰酸钾、浓硫酸、磷酸的摩尔比为1:（0.3～1）:（15～35）：（2～5）

　　步骤1）中氧化石墨烯与最终生成的四氧化三铁的质量之比为1：1.5～1:4。

　　步骤2）中每1 g 制备得到的Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子置于100-200 mL 乙醇水溶液中，然后加入1-3 mL APTES。

　　本发明步骤1）制得的Fe3O4纳米粒子比表面积大，因而存在于水溶液中时，粒子表面的Fe与O原子容易吸附水中的-OH离子，表面的金属Fe原子一般以Fe-OH形式存在，从而使得其带有了大量的羟基。将Fe3O4纳米粒子浸泡入四甲基氢氧化铵（TMAOH）溶液主要是为了达到粒子表面羟基化的目的。氨基偶联剂水解产生的羟基和磁性纳米粒子表面的羟基会发生脱水反应。硅醇之间形成Si-O-Si共价键，从而使得硅烷试剂接枝到纳米粒子的表面。由于APTES末端含有功能基团-NH2，因此经修饰后的磁性纳米粒子表面就带有丰富氨基，即制得氨基化Fe3O4纳米粒子。

　　由于使用的固定化材料为氧化石墨烯和四氧化三铁的复合材料，其中氧化石墨烯的含量大约占了四分之一，由于氧化石墨烯的表面富有丰富的羟基，羧基；因此在四甲基氢氧化铵处理磁性石墨烯的会更快，其材料表面会含有更多的羟基，其材料表面的羟基化会更好，以至于其氨基化修饰会更好，其材料的表面会含有更丰富的氨基，进而能够固定上更多的漆酶，其相同重量下固定化载体能够固定更多的漆酶，其漆酶的酶活更高。

　　本发明首次将漆酶与介体共固定于磁性氧化石墨烯载体上，运用氧化还原法和化学共沉淀法制备的氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子载体，制备工艺简单、成本低廉，并同时共价交联漆酶和TEMPO介体，构建了高效的漆酶-介体催化系统，共固定化的漆酶- 介体系统能够最终靠外部磁场简便回收，反复使用，来提升酶和介体的利用率，降低生产所带来的成本，同时由于氧化石墨烯是炭基材料，本身对各种染料具有非常好的吸附特性。因此，在漆酶降解和氧化石墨烯吸附两个方面的联合作用下，其降解效率大大的提高，能达到95%左右。

　　本实施例中所使用的漆酶购于SIGMA公司，所使用的4-NH2-TEMPO 购于梯希爱化成工业发展有限公司。

　　氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统的制备方法，包括如下步骤：

　　（1）Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子的制备：先将1.0 g 石墨粉、6.0 g 高锰酸钾、120 mL 浓硫酸、13.3 mL 的磷酸加入到500 mL的三口烧瓶中充分混合，烧瓶置于冰水浴条件下，控制其在混合过程中的温度小于35℃，混合完成后，加热至50℃，搅拌10 h，反应完成后冷却至室温，加入150 mL冰水（含有10 mL 30% （wt）H2O2），继续搅拌1h,反应完全后依次使用200 mL去离子水、200 mL30%HCl、200 mL乙醇洗涤，最后溶液离心，真空干燥，即可得到氧化石墨烯；再将称取100mg制备好的氧化石墨烯，配置成1mg/mL溶液备用，再将0.847 mmol FeCl2·4H2O和1.695 mmol FeCl3·6H2O溶于100mL 去离子水中，将制备的石墨烯溶液与铁盐溶液充分混合，在N2保护、搅拌、85°C 水浴的条件下，逐滴滴加20 mL NH3·H2O溶液，使溶液的pH10，并持续搅拌45min后，将黑色产物分离出来，去离子水洗至中性，得到Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子，然后将Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子置于7 (wt)% 的四甲基氢氧化铵水溶液中静置2 h，用水洗涤3-5 次备用；

　　（2）Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子表面修饰APTES ：取1 g 制备得到的Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子置于150 mL 乙醇水溶液（体积比1:1）中，然后加入2 mL APTES，50℃，搅拌反应10h。反应产物用去离子水清洗3-5 次后，真空干燥，得到表面氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子。

　　（3）介体的固定化：取1 g 制备得到的氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子置于质量浓度为2% 的戊二醛溶液中静置2h，去离子水洗数次以除去多余的戊二醛。加入2.5 mmol 4-NH2-TEMPO，室温下震荡反应5h，反应结束后，分离出产物，水洗，得到接枝了介体的纳米粒子。

　　（4）漆酶的固定：取25 U 漆酶加10 mL50 mM pH 4.5 的乙酸-乙酸钠缓冲中，再加入100 mg 接枝了介体的纳米粒子，35°C 震荡反应5h 后，50 mM pH 4.5 的乙酸-乙酸钠缓冲清洗数次，以洗去未固定的酶，置于4℃冰箱备用，得到氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统（即漆酶与介体共固定化的磁性氧化石墨烯纳米粒子）。每1g 共固定化漆酶与介体的磁性氧化石墨烯纳米粒子中固定有0.5mmol 介体, 固定化后的漆酶酶活为150 U/g。

　　考察上述磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统在降解染料废水中的应用效果，选取酸性品红染料，采用50 mM pH 4.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液配制成50 mg/L 的酸性品红溶液，向250mL 锥形瓶中加入100 mL酸性品红染料、100mg 上述制备的共固定化磁性氧化石墨烯纳米粒子，总反应体系为100mL。50℃下置于100rpm 恒温震荡仪中反应，间隔2 h 测定最大吸收波长处吸光值的变化。脱色率=(1-A/A0) *100%，A0为脱色反应前溶液吸光值，A 为脱色反应后溶液吸光值，所有脱色反应均重复3 次取平均，计算脱色率达94.73%。而在没有TEMPO 的参与下，仅加入同等酶活力的游离漆酶，脱色率仅有3.38%。

　　氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统的制备方法，包括如下步骤：

　　（1）Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子的制备：先将1.0 g 石墨粉、6.0 g 高锰酸钾、120 mL 浓硫酸、13.3 mL 的磷酸加入到500 mL的三口烧瓶中充分混合，烧瓶置于冰水浴条件下，控制其在混合过程中的温度小于35℃，混合完成后，加热至50℃，搅拌10 h，反应完成后冷却至室温，加入150 mL冰水（含有10 mL 30% H2O2），继续搅拌1h,反应完全后依次使用200 mL去离子水、200 mL30%HCl、200 mL乙醇洗涤，最后溶液离心，真空干燥，即可得到氧化石墨烯；再将称取100mg制备好的氧化石墨烯，配置成1mg/mL溶液备用，再将0.847 mmol FeCl2·4H2O和1.695 mmol FeCl3·6H2O溶于100mL 去离子水中，将制备的石墨烯溶液与铁盐溶液充分混合，在N2保护、搅拌、85°C 水浴的条件下，逐滴滴加20 mL NH3·H2O溶液，使溶液的pH10，并持续搅拌45min后，将黑色产物分离出来，去离子水洗至中性，得到Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子，然后将Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子置于7 (wt)% 的四甲基氢氧化铵水溶液中静置2 h，用水洗涤3-5 次备用；

　　（2）Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子表面修饰APTES ：取1 g 制备得到的Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子置于150 mL 乙醇水溶液（体积比1:1）中，然后加入2 mL APTES，50℃，搅拌反应10h。反应产物用去离子水清洗3-5 次后，真空干燥，得到表面氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子。

　　（3）介体的固定化：取1 g 制备得到的氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子置于质量浓度为2% 的戊二醛溶液中静置2h，去离子水洗数次以除去多余的戊二醛。加入1.5 mmol 4-NH2-TEMPO，室温下震荡反应5h，反应结束后，分离出产物，水洗，得到接枝了介体的纳米粒子。

　　（4）漆酶的固定：取25 U 漆酶加10 mL50 mM pH 4.5 的乙酸-乙酸钠缓冲中，再加入100 mg 接枝了介体的纳米粒子，35°C 震荡反应5h 后，50 mM pH 4.5 的乙酸-乙酸钠缓冲清洗数次，以洗去未固定的酶，置于4℃冰箱备用，得到氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统（即漆酶与介体共固定化的磁性氧化石墨烯纳米粒子）。每1g 共固定化漆酶与介体的磁性氧化石墨烯纳米粒子中固定有0.3mmol 介体, 固定化后的漆酶酶活为150 U/g。

　　考察上述磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统在降解染料废水中的应用效果，选取酸性品红染料，采用50 mM pH 4.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液配制成50 mg/L 的酸性品红溶液，向250mL 锥形瓶中加入100 mL酸性品红染料、100mg 上述制备的共固定化磁性氧化石墨烯纳米粒子，总反应体系为100mL。50℃下置于100rpm 恒温震荡仪中反应，间隔2 h 测定最大吸收波长处吸光值的变化。脱色率=(1-A/A0) *100%，A0为脱色反应前溶液吸光值，A为脱色反应后溶液吸光值，所有脱色反应均重复3 次取平均，计算脱色率达83.64%。而在没有TEMPO 的参与下，仅加入同等酶活力的游离漆酶，脱色率仅有3.09%。

　　氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统的制备方法，包括如下步骤：

　　（1）Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子的制备：先将1.0 g 石墨粉、6.0 g 高锰酸钾、120 mL 浓硫酸、13.3 mL 的磷酸加入到500 mL的三口烧瓶中充分混合，烧瓶置于冰水浴条件下，控制其在混合过程中的温度小于35℃，混合完成后，加热至50℃，搅拌10 h，反应完成后冷却至室温，加入150 mL冰水（含有10 mL 30% H2O2），继续搅拌1h,反应完全后依次使用200 mL去离子水、200 mL30%HCl、200 mL乙醇洗涤，最后溶液离心，真空干燥，即可得到氧化石墨烯；再将称取100mg制备好的氧化石墨烯，配置成1mg/mL溶液备用，再将0.847 mmol FeCl2·4H2O和1.695 mmol FeCl3·6H2O溶于100mL 去离子水中，将制备的石墨烯溶液与铁盐溶液充分混合，在N2保护、搅拌、85°C 水浴的条件下，逐滴滴加20 mL NH3·H2O溶液，使溶液的pH10，并持续搅拌45min后，将黑色产物分离出来，去离子水洗至中性，得到Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子，然后将Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子置于7 (wt)% 的四甲基氢氧化铵水溶液中静置2 h，用水洗涤3-5 次备用；

　　（2）Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子表面修饰APTES ：取1 g 制备得到的Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子置于150 mL 乙醇水溶液（体积比1:1）中，然后加入2 mL APTES，50℃，搅拌反应10h。反应产物用去离子水清洗3-5 次后，真空干燥，得到表面氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子。

　　（3）介体的固定化：取1 g 制备得到的氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子置于质量浓度为2% 的戊二醛溶液中静置2h，去离子水洗数次以除去多余的戊二醛。加入1.5 mmol 4-NH2-TEMPO，室温下震荡反应5h，反应结束后，分离出产物，水洗，得到接枝了介体的纳米粒子。

　　（4）漆酶的固定：取20 U 漆酶加10 mL50 mM pH 4.5 的乙酸-乙酸钠缓冲中，再加入100 mg 接枝了介体的纳米粒子，35°C 震荡反应5h 后，50 mM pH 4.5 的乙酸-乙酸钠缓冲清洗数次，以洗去未固定的酶，置于4℃冰箱备用，得到氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统（即漆酶与介体共固定化的磁性氧化石墨烯纳米粒子）。每1g 共固定化漆酶与介体的磁性氧化石墨烯纳米粒子中固定有0.3 mmol 介体, 固定化后的漆酶酶活为120 U/g。

　　考察上述磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统在降解染料废水中的应用效果，选取酸性品红染料，采用50 mM pH 4.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液配制成50 mg/L 的酸性品红溶液，向250mL 锥形瓶中加入100 mL酸性品红染料、100mg 上述制备的共固定化磁性氧化石墨烯纳米粒子，总反应体系为100mL。50℃下置于100rpm 恒温震荡仪中反应，间隔2 h 测定最大吸收波长处吸光值的变化。脱色率=(1-A/A0) *100%，A0为脱色反应前溶液吸光值，A 为脱色反应后溶液吸光值，所有脱色反应均重复3 次取平均，计算脱色率达82.72%。而在没有TEMPO 的参与下，仅加入同等酶活力的游离漆酶，脱色率仅有2.98%。

　　氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统的制备方法，包括如下步骤：

　　（1）Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子的制备：先将1.0 g 石墨粉、6.0 g 高锰酸钾、120 mL 浓硫酸、13.3 mL 的磷酸加入到500 mL的三口烧瓶中充分混合，烧瓶置于冰水浴条件下，控制其在混合过程中的温度小于35℃，混合完成后，加热至50℃，搅拌10 h，反应完成后冷却至室温，加入150 mL冰水（含有10 mL 30% H2O2），继续搅拌1h,反应完全后依次使用200 mL去离子水、200 mL30%HCl、200 mL乙醇洗涤，最后溶液离心，真空干燥，即可得到氧化石墨烯；再将称取100mg制备好的氧化石墨烯，配置成1mg/mL溶液备用，再将0.847 mmol FeCl2·4H2O和1.695 mmol FeCl3·6H2O溶于100mL 去离子水中，将制备的石墨烯溶液与铁盐溶液充分混合，在N2保护、搅拌、85°C 水浴的条件下，逐滴滴加20 mL NH3·H2O溶液，使溶液的pH10，并持续搅拌45min后，将黑色产物分离出来，去离子水洗至中性，得到Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子，然后将Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子置于7 (wt)% 的四甲基氢氧化铵水溶液中静置2 h，用水洗涤3-5 次备用；

　　（2）Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子表面修饰APTES ：取1 g 制备得到的Fe3O4磁性氧化石墨烯纳米粒子置于150 mL 乙醇水溶液（体积比1:1）中，然后加入2 mL APTES，50℃，搅拌反应10h。反应产物用去离子水清洗3-5 次后，真空干燥，得到表面氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子。

　　（3）介体的固定化：取1 g 制备得到的氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子置于质量浓度为2% 的戊二醛溶液中静置2h，去离子水洗数次以除去多余的戊二醛。加入1.5 mmol 4-NH2-TEMPO，室温下震荡反应5h，反应结束后，分离出产物，水洗，得到接枝了介体的纳米粒子。

　　（4）漆酶的固定：取20 U 漆酶加10 mL50 mM pH 4.5 的乙酸-乙酸钠缓冲中，再加入100 mg 接枝了介体的纳米粒子，35°C 震荡反应5h 后，50 mM pH 4.5 的乙酸-乙酸钠缓冲清洗数次，以洗去未固定的酶，置于4℃冰箱备用，得到氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统（即漆酶与介体共固定化的磁性氧化石墨烯纳米粒子）。每1g 共固定化漆酶与介体的磁性氧化石墨烯纳米粒子中固定有0.3 mmol 介体， 固定化后的漆酶酶活为120 U/g。

　　考察上述磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统在降解染料废水中的应用效果，选取酸性品红染料，采用50 mM pH 4.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液配制成50 mg/L 的酸性品红溶液，向250mL 锥形瓶中加入100 mL酸性品红染料、100mg 上述制备的共固定化磁性氧化石墨烯纳米粒子，总反应体系为100mL。50℃下置于100rpm 恒温震荡仪中反应，间隔2 h 测定最大吸收波长处吸光值的变化。脱色率=(1-A/A0) *100%，A0为脱色反应前溶液吸光值，A为脱色反应后溶液吸光值，所有脱色反应均重复3次取平均，计算脱色率达74.37%。而在没有TEMPO 的参与下，仅加入同等酶活力的游离漆酶，脱色率仅有2.34%。

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